Identificação de consumidores de glicano em amostras de microbiota intestinal humana usando marcação metabólica juntamente com fluorescência

Nature Communications volume 14, número do artigo: 662 (2023) Citar este artigo

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A composição e o metabolismo da microbiota intestinal humana são fortemente influenciados pelos glicanos complexos da dieta, que causam efeitos posteriores na fisiologia e na saúde dos hospedeiros. Apesar dos recentes avanços na nossa compreensão do metabolismo dos glicanos pelas bactérias intestinais humanas, ainda precisamos de métodos para ligar os glicanos às bactérias que os consomem. Aqui, usamos um ensaio funcional para identificar e isolar bactérias intestinais de voluntários humanos saudáveis que absorvem diferentes glicanos. O método combina marcação metabólica usando oligossacarídeos fluorescentes com classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), seguida de sequenciamento de amplicon ou culturômica. Nossos resultados demonstram marcação metabólica em vários táxons, como Prevotella copri, Collinsella aerofaciens e Blautia wexlerae. A validação in vitro confirma a capacidade da maioria, mas não de todas, as espécies marcadas de consumir o glicano de interesse para o crescimento. Paralelamente, mostramos que os consumidores de glicano abrangendo três filos principais podem ser isolados de culturas de células marcadas classificadas. Ao ligar as bactérias aos glicanos que elas consomem, esta abordagem aumenta a nossa compreensão básica do metabolismo dos glicanos pelas bactérias intestinais. No futuro, poderia ser usado para fornecer informações sobre o mecanismo das abordagens prebióticas, onde os glicanos são usados para manipular a composição da microbiota intestinal.

A microbiota intestinal é parte integrante da fisiologia humana, pois metaboliza a nossa dieta, sintetiza vitaminas e aminoácidos essenciais, treina o sistema imunitário e protege-nos de agentes patogénicos1,2,3,4,5. Os avanços nas ferramentas genéticas e bioinformáticas levaram a uma nova compreensão da complexidade e diversidade da microbiota intestinal, bem como da sua importância nas doenças humanas6. O microbioma intestinal é enriquecido em genes envolvidos na glicólise e no metabolismo de carboidratos2,7. Através destas enzimas ativas em carboidratos (CAZymes), as bactérias intestinais metabolizam glicanos complexos derivados da dieta (fibras alimentares) que chegam ao cólon não digeridos pelo hospedeiro8,9. Consequentemente, a dieta é um dos principais determinantes da composição e diversidade da microbiota intestinal, mais do que os factores genéticos10. Na verdade, mudanças na dieta normalmente resultam em rápidas modificações metabólicas microbianas e em uma estrutura alterada da comunidade microbiana7,11. É importante ressaltar que mesmo diferenças estruturais sutis nos glicanos podem produzir resultados metabólicos microbianos distintos em estudos de suplementação humana12.

Nossa compreensão dos CAZymes está avançando rapidamente, como exemplificado pela caracterização de loci de utilização de polissacarídeos (PULs) em Bacteroidetes, como o sistema de utilização de amido (SUS) extensivamente estudado em Bacteroides thetaiotaomicron . O locus Sus codifica proteínas responsáveis pela ligação (SusDEF) e degradação da superfície celular (SusG) de polissacarídeos de amido em oligossacarídeos que são transportados para o periplasma pelo transportador SusC dependente de TonB, onde são posteriormente processados em monossacarídeos pelas hidrolases glicosídicas. GHs) SusAB14. Da mesma forma, PULs específicos foram descritos para muitos outros glicanos, como manano, β-glucano, xiloglucano e galactomanano15,16,17,18,19. Por outro lado, bactérias Gram-positivas contêm transportadores que podem internalizar estruturas de oligossacarídeos, como frutooligossacarídeos (FOS) pelo MsmEFGK de quatro componentes em Lactobacillus acidophilus20, ou β-mananas por uma proteína de ligação a soluto (MnBP) e duas permeases (MPP) em Roseburia intestinalis21. Apesar desses avanços, muitos PULs ainda possuem especificidades de substrato desconhecidas, e as famílias de GH podem ter múltiplos substratos, dificultando a previsão da atividade com base no sequenciamento9,13,22,23,24. Assim, são necessários métodos funcionais que liguem os glicanos aos seus consumidores primários, especialmente para Firmicutes e outros membros menos estudados da microbiota intestinal humana25.

99% identity and coverage). Note that all annotations are considered putative and subject to improvement as database errors are resolved and new species are characterized./p>99% identity, and 100% identity was obtained for 86 out of the 93 ESVs. The sorted glycan+ samples exhibited lower bacterial α-diversity indices (observed ESVs, Chao1, and Shannon) than those of the starting stool samples, which is consistent with the labeled cells representing a subset of the initial gut microbiota samples (Fig. S3a). A principal component analysis (PCoA) showed a clustering of samples according to the individual (Fig. S3b), indicating that interpersonal differences in microbial communities explained most of the variance (45%). However, constrained ordination (CAP) analysis was performed using the labeled cells versus the initial stool samples as an a priori hypothesis and produced two distinct clusters on an ordination axis; this result explained 9% of the variance (Fig. S3c) and once again supported the enrichment of specific bacterial taxa from the original stool sample. Clustering of NYST-F+ cells from the other two probes was observed by further constraining the analysis by glycan type (Fig. S3d)./p>99% identity and coverage thresholds. α- and β-diversity and ordination were analyzed using R scripts with the vegan library, and differential abundance analysis was performed using DESeq249./p>